PEWARNAAN GRAM

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

PEWARNAAN GRAM

Nama Praktikan	NIM	Tanggal Kumpul	Tanda tangan
Tria Wardhani	PO7133112041	19 November 2012	Praktikan	Pembimbimg

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN BANJARMASIN

PROGRAM DIPLOMA III

KESEHATAN LINGKUNGAN

BANJARBARU

2012

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi guna pencirian dan identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu karena bnkteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna  merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif dan Gram negatif.

Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi yang sama.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).

A.    Tujuan

Praktikum pewarnaan gram memiliki tujuan:

1.      Untuk mengetahui sifat bakteri;

2.      Untuk mengetahui faktor-faktor yang berpengaruh pada saat pewarnaan gram;

3.      Untuk mengetahui teknik pewarnaan  gram;

4.      dan juga untuk memenuhi tugas laporan praktikum.

B.     Manfaat

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.    Pengertian Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan DenmarkHans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

B.     Sejarah Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1.      Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2.      Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3.      Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

1.      Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

1.       Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

2.      Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

3.      Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.

4.      Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada.

A.    Pengertian Violet gentian

Nama "gentian violet" (atau Gentianaviolett dalam bahasa Jerman) diperkirakan telah diperkenalkan oleh apoteker George Jerman Grübler yang pada tahun 1880 menciptakan sebuah perusahaan di Leipzig yang mengkhususkan diri dalam penjualan reagen pewarnaan untuk histologi .The gentian violet noda dipasarkan oleh Grübler mungkin berisi campuran pewarna pararosaniline alkohol. Noda terbukti populer dan pada tahun 1884 digunakan oleh Hans Christian Gram untuk noda bakteri. Dia dikreditkan Paul Ehrlich untuk campuran violet anilin-gentian.  gentian violet Grübler itu mungkin sangat mirip, jika tidak identik, untuk metil ungu Lauth itu yang telah digunakan sebagai noda oleh Victor André Cornil pada tahun 1875.

Meskipun gentian violet nama terus digunakan untuk noda histologis, nama itu tidak digunakan dalam industri pewarna dan tekstil. Komposisi noda tidak didefinisikan dan pemasok yang berbeda menggunakan campuran yang berbeda. Pada tahun 1922 Komisi Stain Biologi menunjuk sebuah komite diketuai oleh Harold Conn untuk melihat ke dalam kesesuaian produk komersial yang berbeda. Dalam buku Biologi Stains nya Conn menggambarkan gentian violet sebagai "campuran buruk didefinisikan rosanilins violet".

Jerman ophthalmologist menenangkan Jakob dikreditkan dengan menemukan sifat antiseptik gentian violet.  Ia menerbitkan monografi tahun 1890 tentang efek bakterisidal solusi yang ia namai "pyoktanin" yang mungkin campuran pewarna anilin mirip dengan gentian violet.  Ia mendirikan sebuah kolaborasi dengan E. Merck & Co untuk memasarkan "Pyoktanin caeruleum" sebagai antiseptik.

Pada tahun 1902, Drigalski dan Conradi menemukan bahwa meskipun kristal violet menghambat pertumbuhan bakteri banyak, ia memiliki pengaruh yang kecil pada coli Bacillus ( Escherichia coli ) dan Bacillus typhi ( Salmonella typhi ), yang keduanya bakteri Gram-negatif .  Sebuah banyak penelitian yang lebih rinci efek gentian violet Grübler pada strain bakteri yang berbeda diterbitkan oleh John rohaniawan pada tahun 1912.  Ia menemukan bahwa bakteri yang paling Gram-positif yang sensitif terhadap pewarna sementara sebagian besar bakteri Gram-negatif tidak dan mengamati bahwa pewarna cenderung untuk bertindak sebagai agen bakteriostatik daripada bakterisida .

BAB III

PELAKSANAAN KEGIATAN

A.    Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Hari/tanggal    : Senin, 12 November 2012

Waktu             : 09.00-11.15 WITA

Tempat            : Lab. Mikrobiologi Lingkungan Jurusan Kesling

B.     Jenis kegiatan

Pemeriksaan pewarnaan gram

C.    Uraian Kegiatan

1)      Persiapan sampel

1.      Siapkan objek glass yang bersih dari lemak;

2.      Gunakan jarum ose steril, ambil sampel sedikit bakteri di agar nutrient pada tabung reaksi;

3.      Berikan NaCl satu tetes pada permukaan kaca preparat;

4.      Campurkan sampel bakteri pada tetes NaCl kemudian putar searah jarum jam;

5.      Setelah itu bakar jarum ose hingga pijar karena bekas mengambil sampel bakteri;

6.      Uapkan NaCl yang telah tercampur dengan sampel bakteri pada lidah api bunsen;

7.      Bila sudah kering lalu di fiksasi dengan cara lewati lidah api sebanyak tiga kali;

2)      Persiapan pewarnaan

1.      Oleskan perwarna pertama Gentian Violet di atas kaca preparat yang berisi sediaan bakteri sampai menutupi sampel bakteri yang sudah mengering dan tunggu dalam tiga menit;

2.      Lalu cuci dengan air keran hingga bersih;

3.      Tambahkan Lugol pada kaca preparat hingga menutupi sampel bakteri dan tunggu selama satu menit;

4.      Kemudian cuci dengan alkohol 96% hingga merata, bertujuan untuk sampel warna pertama dapat larut;

5.      Lalu cuci dengan air keran hingga bersih;

6.      Lalu beri warna kedua Fucsin pada kaca preparat hingga menutupi sampel bakteri selama dua menit;

1.      Lalu cuci dengan air keran hingga bersih;

2.      Kemudian di keringkan atau diangin-anginkan dan diberi alas tisu agar sisa warna tidak berceceran;

3.      Setelah semua kering lalu beri minyak pelicin lalu amati dengan mikroskop;

4.      Atur mikroskop terang gelapnya dan fokuskan obyeknya pada mikroskop.

D.    Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan gram kali ini yaitu:

1)      Jarum ose;

2)      Alkohol 96%;

3)      Pipet tetes;

4)      Tissue;

5)      Gelas objek;

6)      Korek api;

7)      Bunsen;

8)      Air keran atau aquadest;

9)      Larutan Gentian Kristal Violet;

10)  Larutan Lugol;

11)  Kaca preparat;

12)  Karbol Fuchsin Z;

13)  Mikroskop.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil

Hasil pewarnaan Gram

Bakteri Gram positif: Biru-ungu (ungu kebiru-biruan).

Bakteri Gram negatif: Merah kekuning-kuningan.

B.     Pembahasan

Perbedaan antar gram positif dan negatif adalah pada lapisan dinding selnya. Pada bakteri gram positif, dinding selnya sebagian besar terdiri atas peptidoglikansehingga akan menghasilkan warna ungu pada pewarnaan gram, sedangkan bakteri gram negatif, dinding selnya sebagian baser terdiri atas lipid atau lemak dankadar peptidoglikan sangat rendah sehingga akan menghasilkan warna merah pada pewarnaan gram.

Perbedaan bakteri gram positif dan negatif apabila dilihat di bawah mikroskop adalah warna yang dihasilkan bakteri. Bakteri garam positif menyerap warnaungu sedangkan pada bakteri gram negatif menyerap warna merah. Menurut Wahyuni (2011) pada bakteri gram positif, larutan ungukristal membuat sel berwarna ungu. Saat penetesan larutan iodium, kompleks ungu kristal-iodium terbentuk di dalam sel. Dinding sel